Лаборатория генной инженерии

О Центре

Структура

Институт экспериментальной кардиологии им. ак. В.Н. Смирнова

Лаборатория создана в 1983 году.

Направления научной деятельности

Энзимология и белковая инженерия ферментов, реализующих фибринолиз. Получение продуцентов этих ферментов генно-инженерными методами. Внесение направленных изменений в структуру гена, позволяющих получать белки с заранее заданными свойствами. Создание тромболитических препаратов на основе рекомбинантных белков человека с модифицированной первичной структурой.
Изучение механизмов действия ферментных систем матричного синтеза нуклеиновых кислот и регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции. Работы фокусируются на исследовании особенностей экспрессии тысяч генов методом транскрипционных матриц и ОТ-ПЦР при различных кардиологических (гипертония, атеросклероз) и онкологических заболеваниях (миксома сердца, меланома).

Наиболее значимые результаты исследований

Несмотря на многочисленные исследования последних десятилетий, задача лечения тромбозов остается не решенной. В настоящее время проводятся интенсивные поиски как новых методов разрушения и устранения тромбов, так и совершенствование известных лекарственных средств и протоколов их применения.

В случае развития тромба в сосудах, особенно в артериях, единственным консервативным способом восстановления кровотока является его растворение (лизис). В связи с этим тромболитические препараты являются лекарствами первого ряда в лечении данных заболеваний.

В Лаборатории фундаментальные и прикладные научные исследования, направленные на разработку новых поколений тромболитических препаратов, проводятся с 80-х годов прошлого века. С использованием методов генной инженерии был создан тромболитический препарат третьего поколения, который представляет собой модифицированный рекомбинантный фибринспецифичный активатор плазминогена урокиназного типа. Активатор производится штаммом бактерии E.coli, в которую встраивается плазмида, несущая ген модифицированной молекулы нативной проурокиназы человека с заменой 24 аминокислотных остатков эндотелиального фактора роста (N-концевого домена). Изменение последовательности аминокислотных остатков эндотелиального фактора роста привело к тому, что синтезированная молекула не связывается со специфическими рецепторами на поверхности клеток и таким образом не способна создавать какие-либо потенциально возможные побочные эффекты, связанные с активизацией регуляторных процессов, контролирующих миграцию клеток и ремоделирование тканей. Рекомбинантная проурокиназа специфически взаимодействует с фибринсвязанным плазминогеном и катализирует превращение плазминогена в плазмин – протеазу, способную растворять фибриновые сгустки (тромбы). Исследования энзимологических и фармакокинетических свойств препарата рекомбинантной проурокиназы были проведены в Лаборатории. Рекомбинантная проурокиназа – один из наиболее распространенных препаратов, разрешенных к применению в России. Наряду с «Альтеплазой», рекомбинатной производной второго активатора плазминогена, рекомбинатная проурокиназа под именем «Пуролаза» с 2000 года успешно используется для лечения инфаркта миокарда. Пуролаза, в отличие от Альтеплазы не нейротоксична. Подобная пуролазе по структуре молекула в несколько отличной композиции под именем «Гемаза» широко используется в офтальмологии. Оба этих фермента не являются прямыми фибринолитиками, а являются активаторами плазминогена превращающего неактивный плазминоген в плазмин. Очень короткоживущий в активированной форме благодаря высокой концентрации в крови его двух энергичных ингибиторов – альфа-2-антиплазмина и альфа -2- макроглобулина. Система активатор – плазминоген, в которой образующийся плазмин сам является активатором исходно неактивной проурокиназы, благодаря автокаталитической цепной реакции очень быстро и локально достигает высоких концентраций. Система хорошо работает при свежих и не очень протяженных тромбозах – до 2-3 часов после образования. Лечение активаторами наиболее эффективно как скоропомощное средство. При старых или протяженных тромбозах система исчерпывается до завершения растворения тромба. Концентрация плазминогена падает и повторное введение активатора становится не эффективной. Это побудило нас создать генноинженерный плазминоген, который сам по себе или в комбинации с пуролазой может использоваться в течении долгого времени в невысоких концентрациях. Это должно быть эффективно при тромбоэмболиях, тромбозах абдоминальных артерий, венозных тромбозах и других тромбозах, требующих продолжительной, (более 90 мин.) процедуры.

Такой препарат был сделан. Были сделаны неприродные варианты содержащие относительно устойчивые к альфа-2-антиплазмину.

Укороченные (делеционные) варианты плазминогена, лишенные всех или части крингл-доменов с сохраненным протеазным доменом, также рассматриваются в качестве потенциального тромболитика. Мини-плазминоген, состоящий из 5-го крингл-домена и протеазного домена в физиологических условиях получается в результате протеолитического расщепления в молекуле плазминогена эластазой нейтрофилов. Мини-плазминоген способен активироваться точно так же, как полноразмерный плазминоген, образуя мини-плазмин. В Лаборатории был получен рекомбинантный вариант такого мини-плазминогена, получен продуцент, разработана технология производства «миниплазмина». В настоящее время проводятся испытания препарата для тромболитической терапии.

Исследования механизмов неравномерного по времени чтения матричной информации ДНК и РНК полимеразами привело к разработке большой серии аналогов нуклеотидов, терминирующих растущую цепь транскриптов (реплик), один из которых послужил основой для разработки оригинального антиретровирусного препарата, который благодаря низкой токсичности широко применяется для предотвращения заболевания СПИДом новорожденных детей. Он был первым антиспидовским препаратом, разработанным в России и внедренным в практику для лечения больных СПИД еще в девяностых годах прошлого столетия.

При исследовании экспрессии генов в миксоме сердца были выявлены семь генов, одновременная высокая экспрессия которых позволяет однозначно диагностировать миксому, отличая ее от других, в основном злокачественных, опухолей сердца.

Меланома представляет собой одно из самых агрессивных злокачественных новообразований. Пациенты, своевременно прооперированные на первой-второй стадии болезни, делятся на три примерно равные по численности группы: гибнущие в течение 5 лет после операции, рецидивирующие за такой же срок и полностью излеченные. Анализ экспрессии 12 выявленных генов позволил выработать прогностический критерий со специфичностью 78% и чувствительностью 100%, предсказывающий состояние полного выздоровления.

При исследовании по выявлению генов, изменяющих свою активность в лимфоцитах периферической крови при атеросклерозе и артериальной гипертонии и в клетках интимы в атероме в разной степени пораженных атеросклерозом, были обнаружены 13 генов, активность которых высоко коррелирована со степенью атеросклеротического поражения в интиме. Вместе с тем, их активность в клетках периферической крови высоко коррелирована и с гипертонической болезнью, и с атеросклерозом. Активность большей части этих генов ассоциирована с моноцитарными клетками. Активность части этих генов может быть снижена, приближаясь к нормальному значению при лечении блокаторами кальциевых каналов.

Проведены исследования активности генов, ассоциированных с атеросклерозом при модели тепловой волны, подобной тепловой волне лета 2010 года в Европейской части России. Показан полностью обратимый сдвиг активности этих генов у практически здоровых людей в направлении значений, характерных для пациентов с тяжелыми формами атеросклероза.

Достижения Лаборатории

Патенты Российской Федерации на изобретения:

«Способ диагностики миксомы сердца» (RU2261446C1; 2005 г.)
«Способ диагностики миксомы сердца» (RU2271008C1; 2006 г.)
«Рекомбинантный полипептид со свойствами плазминогена человека превращаться при активации в плазмин, который катализирует расщепление фибрина, фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, рекомбинантная плазмидная ДНК для экспрессии полипептида и трансформированная клетка Escherichia coli - продуцент полипептида» (RU2432396C2; 2011 г.)
«Рекомбинантный полипептид со свойствами плазминогена человека превращаться при активации в плазмин, который катализирует расщепление фибрина, фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, рекомбинантная плазмидная ДНК для экспрессии полипептида и трансформированная клетка Escherichia coli - продуцент полипептида» (RU2432397C2; 2011 г.)
«Двухкомпонентная фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитическим действием» (RU2765043C1; 2022 г.)

Список наиболее значимых публикаций лаборатории

Белянко Т.И., Савочкина Л.П., Цоколаева З.И., Бибилашвили Р.Ш Исследование тромбоза в микрососудах с использованием микрочастиц // Кардиологический вестник — 2022. — Спецвыпуск. — С. 17—18.
Скрыпина Н.А., Скамров А.В., Цоколаева З.И., Белянко Т.И., Бибилашвили Р.Ш. Выбор животной модели артериального тромбоза для тестирования нового рекомбинантного тромболитика — делеционного варианта плазминогена человека. Кардиологический вестник. 2020;15(4):35-39. DOI: 10.36396/MS.2020.16.4.005.
Белянко Т.И., Гурский Я.Г., Феоктистова Е.С., Скрыпина Н.А., Бибилашвили Р.Ш. Изменение свойств рекомбинантного плазминогена при внесении точечных мутаций. Кардиологический вестник. 2020; Специальный выпуск:3-4.
Белянко Т.И., Феоктистова Е.С., Скрыпина Н.А., Скамров А.В., Гурский Я.Г., Руткевич Н. М., Добрынина Н. И., Бибилашвили Р.Ш., Савочкина Л.П. Изучение структуры трипсин-подобных сериновых протеиназ. 2. Изучение флуоресценции триптофана у вариантов миниплазминогена с измененной первичной структурой. Биофизика. 2019;64(3):437-445. DOI: 10.1134/S0006302919030037.
Мошетова Л.К., Слонимский Ю.Б., Воробьева И.В., Дгебуадзе А., Агафонова О.В., Дельвер Е.П., Белогуров А.А. Клининческий опыт применения рекомбинантной проурокиназы у пациентов с сочетанной патологией глазного дна при сахарном диабете 2 типа. РМЖ Клиническая офтальмология. 2019;19(2):73 - 79. DOI: 10.32364/2311-7729-2019-19-2-73-79.
Миленькина С.Г., Дельвер Е.П., Белогуров А.А., Бибилашвили Р.Ш., Арзамасцев Е.В., Староверов И.И. Что мы знаем сегодня об отечественном тромболитическом препарате рекомбинантная проурокиназа (пуролаза). Кардиологический вестник. 2019;14(4):12-21. DOI: 10.36396/MS.2019.15.4.002.
Парфенова Е.В., Плеханова О.С., Степанова В.В., Меньшиков М.Ю., Семина Е.В., Бибилашвили Р.Ш., Чазов Е.И. Фибринолитики: от разрушения тромбов до процессов роста и ремоделирования сосудов, нейрогенеза, канцерогенеза и фиброза. Терапевтический архив. 2019;91(9):4-9. DOI: 10.26442/00403660.2019.09.000411.
Белянко Т.И., Гурский Я.Г., Добрынина Н.И., Руткевич Н.М., Савочкина Л.П., Скамров А.В., Скрыпина Н.А., Бибилашвили Р.Ш. Изучение структуры трипсино-подобных сериновых протеиназ 1. Изучение активации миниплазминогена с использованием флуоресценции триптофана. Биофизика. 2018;63(5):859-872. DOI: 10.1134/S0006302918050046.
Феоктистова Е.С., Скамров А.В., Горюнова Л.Е., Хаспеков Г.Л., Осяева М.К., Родненков О. В., Бибилашвили Р. Ш. Анализ изменения экспрессии генов в лейкоцитах крови человека во время испытания, моделирующего условия тепловой волны. Биомедицинская химия. 2017;63:139-146.
Бойко Э.В., Даниличев В.Ф., Сажин Т.Г., Белогуров А.А., Дельвер Е.П., Агафонова О.В., Суворов А.С. Методы клинического применения рекомбинантной проурокиназы в офтальмологической практике. РМЖ Клиническая офтальмология. 2017;2:118-129.
Горюнова Л.Е., Самойлов А.Е., Хаспеков Г.Л., Феоктистова Е.С., Скамров А.В., Лукьянов М.М., Бойцов С.А., Бибилашвили Р.Ш. Сравнительный анализ транскриптомов лейкоцитов периферической крови для идентификации генов повышенного риска развития атеросклероза. Кардиологический вестник. 2015;:608-610.
Горюнова Л.Е., Хаспеков Г.Л., Самойлов А.Е., Феоктистова Е.С., Скамров А.В., Лукьянов М.М., Бойцов С.А., Бибилашвили Р.Ш. Поиск генов-маркеров для ранней диагностики атеросклероза. Кардиологический вестник. 2014;:384-385.
Beloglazova I. B., Zubkova E. S., Stambol’skii D., Plekhanova O. S., Menshikov M. Y., Akopyan Z.h.A, Bibilashvili R. S., Parfenova E. V. Proteolytically inactive recombinant forms of urokinase suppress migration of endothelial cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2014;156(6):756–759. DOI: 10.1007/s10517-014-2442-z.
Руткевич Н.М., Белянко Т.И., Гурский Я.Г., Свешников П., Скрыпина Н.А., Солопова О., Бибилашвили Р.Ш. Моноклональное антитело блокирует активацию плазминогена человека. Биотехнология. 2014;30(3):41-48.

Заведующий лабораторией генной инженерии – Бибилашвили Роберт Шалвович, кандидат физико-математических наук

Сотрудники Лаборатории

Агафонова Ольга Вячеславовна, биолог, кандидат биологических наук
Белогуров Анатолий Александрович, ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук
Дельвер Евгений Петрович, старший научный сотрудник, кандидат биологических наук
Савочкина Лариса Павловна, ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук
Скамров Андрей Викторович, ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук
Феоктистова Евгения Сергеевна, научный сотрудник, кандидат биологических наук
Хаспеков Георгий Леонидович, научный сотрудник, кандидат биологических наук
Гурский Ярослав Георгиевич, научный сотрудник
Ковалевский Дмитрий Анатольевич, биолог, кандидат биологических наук
Руткевич Николай Михайлович, биолог, кандидат биологических наук
Белянко Татьяна Игоревна, биолог
Ефремов Владимир Павлович, инженер